Neue Wasser-Immersions-Objektive für höchste Anforderungen

Will man ein biologisches Präparat, dessen Brechungsindex in der Nähe von 1,33 (Wasser) liegt mit einem hochaperturigen Objektiv untersuchen, so kann ein Öl-Objektiv nur dann ein brauchbares Ergebnis liefern, wenn man nicht zu tief in das Präparat hineinfokussiert. Möchte man tiefer in das Präparat hineinsehen, werden starke sphärische Aberrationen Kontrast und Auflösung zunichte machen.
Ebenso wird die Helligkeit drastisch reduziert, was sich insbesondere in der konfokalen Mikroskopie durch eine extreme Verschlechterung des Signal-Rausch-Verhältnisses bemerkbar macht.
Daher ist ein noch so gutes Öl-Objektiv für ein wasserähnliches Präparat nicht optimal. Bei der Berechnung von Objektiven spielt der Brechungsindex des Präparates (und des Immersionsmediums) eine wesentliche Rolle.
Wird ein Öl-Objektiv berechnet, geht man davon aus, daß die Brechungsindices des Immersionsmediums und des Einbettungsmediums gleich sind (1,52). Bei Wasserobjektiven wird bei der Berechnung der Brechungsindex von 1,33 für Immersion und Einbettung angenommen.

Es gibt in der Objektiv-Palette bereits einige Wasser-Immersionsobjektive:

Multiimmersionsobjektive Plan-NEOFLUAR Imm. , die für Immersion von Wasser bis Öl geeignet sind und für ein Deckglas korrigiert sind.
Objektive ACHROPLAN W, Korrektur ohne Deckglas mit langen Arbeitsabständen, insbesondere für die Verwendung an aufrechten Mikroskopen für Mikroinjektion und patch-clamp.

Soll ein wässriges Präparat unter hohen Anforderungen mikroskopiert werden, beispielsweise - aber nicht nur - in einem Laser Scanning Mikroskop, so sind weitergehende Bedürfnisse zu befriedigen:

• Hohe Apertur für hohe Auflösung, hohe Fluoreszenzhelligkeit und feine optische Schnitte.
• Langer Arbeitsabstand für 3D-Untersuchungen.
• Geringe chromatische Längsaberration, damit die Fokusebenen unterschiedlichster Farben sich decken.
• Geringe chromatische Vergrößerungsdifferenz, damit unterschiedliche Fluoreszenzen deckungsgleich abgebildet werden.
• Ebenes Bildfeld, damit wirklichkeitsgetreue 3D-Rekonstruktion möglich wird.

Um diese Anforderungen zu erfüllen wurde ein neues Objektiv entwickelt:

C-APOCHROMAT 40x/1.2W Korr mit den Eigenschaften:

• ICS-Optik
• Wasser-Immersion für wässrige Proben (vitale Schnitte, Kulturzellen, Präparate mit wässrigem Einbettungsmedium).
• Korrektionsring zur Korrektur von Deckglasdickenunterschieden (0,14...0,18 mm) und zur Korrektur unterschiedlicher Temperaturen (Skalen für 24ºC und 37ºC). Der Korrekturring kann auch zur Anpassung an geringe Abweichungen des Präparats vom Brechungsindex des Wassers benutzt werden.
• Vergrößerungsmaßstab: 40x
• Numerische Apertur 1,2
• Freier Arbeitsabstand 220 Mikrometer
• Bildfeldebnung 25 mm (konventionell) bzw. 12 mm (konfokal).
• Transmission (absolut): 50 % bei 350 nm, 85 % bei 400 nm, 90 % bei 500...700 nm.
• Hohe chromatische Korrektur (entsprechend Objektiven Plan-APOCHROMAT)
• Keine sphärische Aberration in wässrigen Proben.

Hintergrund:
Wenn die Brechungsindices von Einbettungs- und Immersionsmedium nicht übereinstimmen, wird der optische Weg unterschiedlich lang sein. Je nach dem, ob man nur wenig oder aber tief in das Präparat hineinfokussiert, ist der Unterschied vernachlässigbar oder deutlich. Das hat wesentliche sphärische Aberrationen zur Folge, die zu ganz erheblichen Verlusten in Schärfe, Kontrast, Helligkeit und Tiefenauflösung führen.
Zudem wird bei Messungen in axialer Richtung der Maßstab nicht korrekt wiedergegeben. Das führt zu Stauchungen oder Streckungen entlang der Z-Achse.
Um die Z-Verformung zu unterbinden müssen die Brechungsindices übereinstimmen. Eine anschließende Korrektur durch den Rechner ist nur ein Notbehelf, da die shpärischen Aberrationen nicht korrigiert werden können. Deshalb muß die Immersion dem Präparat angepaßt werden.

Objektive mit so hohen Aperturen (in Wasser ist 1,2 eine obere Grenze), sind freilich sehr empfindlich, was unterschiedliche Deckglasdicken angeht. Daher besitzt das Objektiv einen Korrektionsring, mit dem Deckgläser zwischen 0,14 mm und 0,18 mm angepaßt werden können. Aus Gründen der maximalen optischen Leistung ist es aber angebracht, Deckgläser mit engen Toleranzen zu benutzen (z.B. 0.16...0.17). Bei der Verwendung im Laser-Scanning-Mikroskop kann die Deckglasdicke einfach gemessen und die Korrektion daher sehr genau eingestellt werden.

Die Wirkung der Anpassung an den Brechungsindex ist in den folgenden Bildern zu sehen. Es handelt sich um Projektionen von optischen Schnitten, die von fluoreszenzmarkierten Kulturzellen angefertigt wurden. (Präp. Dr. Kartenbeck, Heidelberg, Aufnahmen Carl Zeiss). Angefärbt wurde Cytokeratin mit Fluorescein. Im LSM wurde mit 488 nm angeregt und die Emission mit einem Langpaßfilter 515 aufgenommen (das entspricht der Situation mit dem Filtersatz Nr. 09).
Zwischen dem Deckglas und dem Präparat war eine Wasserschicht von 40 µm Dicke.

Aufnahme mit einem Öl-Objektiv, Apertur 1,4. mit sehr hoher optischer Qualität, aber falsch verwendet durch nicht angepaßte Brechungsindices. Das Original ist 10x weniger hell als die korrekte Aufnahme unten. Ergebnis nicht zufriedenstellend.

Dieselbe Stelle im Präparat, aber mit dem neuen C-APOCHROMAT 40x/1,2W Korr. Deutliche Verbesserung von Schärfe, Kontrast und Helligkeit.

Durch die hohen Transmissionen, auch im ultravioletten Teil des Spektrums, ist das Objektiv auch sehr gut für Messungen mit Ionensonden, z.B. FURA geeignet. Dabei wirkt sich ebenfalls die hohe Apertur vorteilhaft auf das Ergebnis der Fluoreszenzaufnahmen aus.

Anfragen und Hinweise richten Sie bitte an [email protected].