Das ConfoCor System

Neue Wege zur Charakterisierung molekularer Wechselwirkungen

Carl Zeiss stellt das erste kommerziell angebotene Fluoreszenz-Korrelations-Spektrometer vor. Das gemeinsam von Carl Zeiss und der EVOTEC BioSystems GmbH, Hamburg, entwickelte ConfoCor eröffnet neue Wege in der Untersuchung molekularer Wechselwirkungen für die Pharmaforschung, Molekularbiologie, Biotechnologie, Immunologie und für andere Forschungsbereiche.

Das Prinzip der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) ist ebenso einfach wie genial. Das Licht eines Lasers wird durch eine konfokale Optik in ein Volumenelement von ca. 10-15 l (Volumen einer E.coli-Zelle) fokussiert, und die Moleküle in diesem kleinen Volumen werden zur Fluoreszenz angeregt. Das resultierende Fluoreszenzlicht wird ebenfalls durch konfokale Optik auf einen Einzelphotonendetektor geführt. Ist die Konzentration der Probenlösung ausreichend gering, d.h. 1 µM, so halten sich aufgrund der Brown'schen Molekularbewegung nur wenige Moleküle gleichzeitig im Beobachtungsvolumen auf. Je weniger Moleküle sich dort befinden, desto größer ist die Fluktuation aufgrund der Bewegung einzelner Moleküle in das Volumen hinein bzw. aus dem Volumen heraus. In der aus der Fluktuation des Signals berechneten Autokorrelationskurve beobachtet man deshalb bei geringen Teilchenzahlen im Volumenelement größere Amplituden als bei höheren Konzentrationen. Die Amplitude der Autokorrelationsfunktion ist damit ein Maß für die Anzahl der Teilchen (Konzentration), die sich durchschnittlich im Beobachtungsvolumen befinden. Außerdem können die mittlere Aufenthaltsdauer (Diffusionszeit) der Teilchen im Volumenelement und bei definiertem Volumen auch der charakteristische Diffusionskoeffizient (abhängig von Gestalt, Gewicht etc.) berechnet werden.

Wird das untersuchte Teilchen durch ein größeres gebunden, z.B. ein fluoreszenzmarkiertes Antigen durch einen entsprechenden Antikörper, ändert sich die Diffusionseigenschaft des gebildeten Komplexes, und der Bindungsgrad kann charakterisiert werden. Typische Diffusionszeiten eines derartigen Komplexes liegen im Millisekundenbereich. Dadurch ergeben sich bei nanomolaren Konzentrationen Meßzeiten von wenigen Sekunden.

Dem breiten Einsatz der Methode waren bislang instrumentelle Grenzen gesetzt. Mit dem ConfoCor wird erstmals ein System angeboten, das Anwendern ohne tiefgehende physikalische Vorkenntnisse routinemäßige Untersuchungen mit FCS erlaubt. Anspruchsvolle Zeiss Mikroskopoptik und Signalverarbeitung wurden in einer benutzerfreundlichen Umgebung zur Realisierung des Meßprinzips eingesetzt. Die Software "Axxess-to-FCS" von EVOTEC ermöglicht nahezu in Echtzeit die exakte Bestimmung der aus den Messungen ableitbaren Parameter der untersuchten Moleküle. Dazu gehören Diffusionszeit, Bindungskonstante, Konzentrationen sowie reaktionskinetische Konstanten. Mit dem ConfoCor können frei von unspezifischen Grenzflächenreaktionen funktionale Wechselwirkungen im homogenen Assay untersucht werden. Dabei sind im Gegensatz zu anderen Methoden keine zwischengeschalteten Wasch- oder Pipettierschritte notwendig.

Von besonderem Interesse für zellbiologische Fragestellungen ist die Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen Rezeptoren und entsprechenden Liganden. Durch die hohe Sensitivität der FCS-Technologie wird es möglich, Primärzellen zu untersuchen, auf deren Oberfläche sich nur eine geringe Anzahl Rezeptoren befindet.

Mit dem ConfoCor können quantitativ Wechselwirkungen von Proteinen und Nukleinsäuren oder die Hybridisierung verschiedener Nukleinsäuren, frei von radioaktiver Markierung oder Filtern in nativer Umgebung in Lösung, analysiert werden.

Kooperation Carl Zeiss / EVOTEC

Neue ultrasensitive Bioanalytik für die Forschung und Routine

Die Carl Zeiss Jena GmbH und die EVOTEC BioSystems GmbH haben eine langfristige Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Analytik molekulaler Wechselwirkungen vereinbart. Ziel der Kooperation ist die gemeinsame Entwicklung und Vermarktung eines neuartigen ultrasensitiven Fluoreszenznachweises mit einem vielfältigen Anwendungspotential in der molekularbiologischen und pharmazeutischen Forschung, der medizinischen Labordiagnostik und der industriellen Analytik.

Strategische Allianzen zwischen traditionsreichen Großunternehmen und jungen High-Tech-Firmen sind - im Unterschied zu den USA - in Deutschland noch äußerst selten. Die 1993 in Hamburg gegründete EVOTEC BioSystems GmbH versteht sich in der neuen Partnerschaft als Katalysator, um eine in der biophysikalischen Wissenschaft entwickelte Arbeitsmethode gemeinsam mit dem im Bau analytischer Geräte erfahrenen Partner Carl Zeiss serienreif und marktwirksam zu machen.

Die Grundlagen für die Anwendungsbreite der als Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) bezeichneten Methode legten der Humboldt-Preisträger und Direktor des Karolinska Institutes Stockholm, Rudolf Rigler, und der Nobelpreisträger Manfred Eigen, Direktor eines Max-Planck-Institutes in Göttingen. Beide Wissenschaftler gehören zu den Mitbegründern der EVOTEC BioSystems GmbH, die diese Methode zur Entwicklung neuer pharmazeutischer Substanzen und von umweltschonenden Enzymen einsetzen wird. Im Rahmen der Kooperation von Carl Zeiss und EVOTEC entstehen dabei marktfähige Meßsysteme und Assays.

Mit Hilfe der FCS-Technik werden anhand des statistischen Fluoreszenzsignals Teilchenfluktuationen in einem extrem kleinen Volumen gemessen und daraus Teilchengröße und -anzahl berechnet. Gegenüber der klassischen Fluoreszenzanalytik zeichnet sich die FCS-Technik besonders dadurch aus, daß die Meßgenauigkeit mit geringer werdender Konzentration zunimmt. So können an einem einzelnen Molekül, einem Viruspartikel oder an einer einzelnen Zelle molekulare Eigenschaften gemessen werden, die wesentliche Aussagen über deren biologische Funktion zulassen. Bindungszustände und chemische Reaktionen sind sowohl für die molekularbiologische Forschung als auch für die Entdeckung neuer pharmazeutischer Wirkstoffe oder für die medizinische Diagnostik von Interesse.

Die FCS gestattet es erstmalig, die empfindlichen Messungen unter nahezu natürlichen Bedingungen und ohne aufwendige Probenvorbereitungsschritte durchzuführen. Mit der FCS kann äußerst schnell im Sekundenbereich und mit extrem kleinen Probenvolumen in Bakterienzellengröße gemessen werden. So könnten z.B. im Screening-Verfahren ganze Substanz-Bibliotheken nach einzelnen Molekülen mit spezifischen Funktionen durchsucht werden. Potentielle Anwendungen werden dabei auch in der Routinekontrolle von Blutkonserven auf gefährliche Viren gesehen, wie z.B. den HIV-Virus.

Im Rahmen der Zusammenarbeit ist Carl Zeiss für die Entwicklung der instrumentellen Technik verantwortlich. Dabei werden modernste Technologien der Zeiss Analysensysteme und der konfokalen Mikroskopie eingesetzt. Das Aufgabengebiet von EVOTEC liegt in der Entwicklung neuartiger mathematischer Auswertesoftware, der Testkit- und Methodenentwicklung sowie der applikativen Kundenberatung. Die enge Verbindung zwischen Informatik und Molekularbiologie ist für die in der Kooperation entwickelten Geräte und Verfahren typisch.

EVOTEC sieht die bei Zeiss vorhandene Kompetenz für den Apparatebau als Garantie für eine sichere Beherrschung der anspruchsvollen Meßtechnik. Carl Zeiss will mit EVOTEC innovative Wege gehen und neue, stark wachsende Märkte erschließen. Beide Partner halten eine Ausweitung der Kooperation auf angrenzende Gebiete für möglich.

Anfragen und Hinweise richten Sie bitte an [email protected].